۱-۱۳ تعریف واژه ها و اصطلاحات فنی و تخصصی
میوم : یک تومور خوش خیم رحمی است که از سلول های عضله صاف رحم بوجود می آید.
پلی مورفیسم : هرگاه جایگاه فروانترین الل آن در جمعیت از ۹۹ درصد کمتر باشد پلی مورفیسم گفته می شود . هرگاه فراوانی جابجایی از ۹۹ درصد کمتر باشد آن را مونوفورمیک می نامند.پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (single – nucleotid polymorphism) شایعترین اشکال جابجایی تک نوکلئوتیدی (A, G, C, T) در ژنوم بین افراد یک گونه ی بیولوژیکی ، یا بین یک جفت کروموزوم در یک فرد،این نوکلئوتید فرق دارد.دریک جمعیت می توان یک فرکانس آلل حداقل به SNP ها نسبت داد.( کمترین فرکانس الل در یک لوکوس که در یک جمعیت خاصی مشاهده شده است).
منوراژی : خونریزی قاعدگی شدید و طولانی مدت را منوراژی می گویند.
دیسمنوره : احساس درد غیر معمول در قسمت شکم هنگام قاعدگی را دیسمنوره می گویند.
Haematometra:تجمع خون در رحم
Multipara :
خانمی که سابقه دو یا چند بار حاملگی به همراه جنین زنده داشته ، خواه بچه موقع تولد زنده بوده یا نبوده است .
Microsatellite instability :
نوعی جهش ژنی در قسمت هایی از DNA که خود مسئول تعمیر DNA هستند.این نواحی ژنی که بنام میکروستالیت نامیده می شوند با این جهش ها کوتاهتر یا بلندتر شده یا توالی بازهایشان تغییر می کند.به این پدیده ناپایداری میکروستالیت می گویند.
CpG island methylation :
جزایر CG نواحی کوتاهی از DNA هستند که توالی های C و G (ستیوزین و گوانین ) در آنها با فرکانس زیادی نسبت به سایر نواحی وجود دارد.همچنین به آن CpG island نیز می گویندکه p نشانه پیوند فسفودی استری است که دونوکلئوتید را به هم وصل می کند.جزایر CG غالباً اطراف نواحی پروموتور ژنهای housekeeping(ژنهای housekeepiny ژنهایی حیاتی هستندکه در اعمال عمومی سلول نقش دارند) یا سایر ژنهای که زیاد در سلول فعال هستند، قرار دارد.در این توالی های CG متیله شده، دیده نمی شود.برعکس در توالیهایی از CG که درنواحی ژنهایی غیر فعال قرار دارند معمولاً متیلاسیون صورت گرفته است که این کار برای خاموش کردن ژنهایی مورد نظر می باشد.
هایپرمتیلیشن :
با افزایش متیلشین ناحیۀ CpG در ژنهای خاموش کنندۀ تومور، از فعالیت این ژنها در سرکوب تشکیل تومور کاسته می شود به همین علت متیلاسیون ژنهای مربوط را به عنوان مارکر شناسایی سرطان کولون معرفی می کنند.
BRAF gene :
این ژن پروتئینی بنام B-Raf proto-oncogene serine/ threonine- protein kinase یا B-RAF را کد می کند که مسئول فرستادن پیام به سلولها و رشد سلولی است.گاهی در ژن BRAF جهش اتفاق می افتدوپروتئین BRAF را تغییر می دهد.این تغییر ژنی که از طریق والدین می تواند منتقل شود باعث نقص های جنینی
می گردد و یا به صورت یک جهش پنهان (oncogene) در بزرگسالی باعث سرطان می شود.
فصل دوم:
مروری بر متون گذشته
مطالعات نشان می دهد که B RAFیک سرین ترئونین کینـاز است که به مسیرRAS/RAF/MEK/ERK/MAPk
تعلق دارد و در هدایت سیگنال های تحریک کننده ی تقسیم میتوز از غشاء سلول به هسته مؤثر است. RASوقتی که به GDP متصل است غیرفعال می شود ولی اگر بهGTP متصل شود فعال می شود وشروع به فسفریلاسیون و فعال کردن ژن B-RAFو فعال سازی مسیرهای سیگنالی می کند.این مسیرهای کینازی در اغلب سرطان های انسانی تحت تاثیرقرارگرفته استیش از۹۰%جهش های B RAF باعثِ جایگزین بازی A به جای Tدرنوکلئوتید ۱۷۹۶ می شودکه باعث تبدیل والین به گلوتامیک اسید درموقعیت ۶۰۰می شود (E600V).
جهش V600E در B RAFبه میزان بسیارزیادی درتخمدان (%۳۰~),تیروئید (%۳۰~) وسرطان های کلورکتال (%۱۵~) (۱۸) ریه وملانوما دیده شده است.درمعرض UV قرارگرفتن به تنهایی نمی تواندعامل جهش باشد.جهش V600E درتومورهای کبد موش به وسیله نیتروزدی اتیل آمین تحریک می شود.بیشترین میزان شیوع جهش های B RAF درتومورهای بدخیم ملانوما(۷۰%-۲۷%) سرطان پاپیلاری تیروئید(۵۳%-۳۶%)وسرطان کلون (۲۲%-۵%)وسرطان تخمدان (%۳۰~) همچنین درفرکانس پایین تری دربقیه سرطان ها(۳%-۱%)وجوددارد.
جهش BRAF باعث فعالسازیERKو این باعث تحریک تبدیل G1/Sدرتنظیم چرخه سلول می شود(۱۶). BRAFبه عنوان یک انکوژن مهم درسرطان های انسانی مطرح است.
جهش نقطه ای سوماتیک درژن BRAF برای اولین باردرسال ۲۰۰۲گزارش شدومشخص شد که تقریبا”در۸%سرطان های انسانی وجود دارد.
در سال۲۰۰۲به وسیله ی دیویس وهمکارانش جهش های نابجای سوماتیک در۶۶% از ملانوماهای بدخیم وبه میزان کمتری در گستره ی وسیعی از سرطان های انسانی مشخص شد.
در سال۲۰۰۲به وسیله ی راجاگو پالان و همکارانش مشخص شد که به طور منظمی جهش درB-RAF وKRASدر ۳۳۰تومور کلورکتال زیاد شد.
در سال ۲۰۰۲ به وسیله ی دیویس و همکارانش یک جابه جایی در نوکلئوتید A-T 1799 در اگزون شماره ۱۵ ژن BRAF یافت شد که این جابه جایی منجر به جانشینی والین در موقعیت ۶۰۰ به اسید گلوتامیک می شد. این جهش برای ۹۲% از جهش های BRAF در ملانومای بدخیم محاسبه شد. جهش V600E یک جهش فعال کننده است که به فعال شدن BRAF در مسیرهای آبشاری سیگنالی مسیر MAP کیناز می شود.
در سال ۲۰۰۳ به وسیله ی بروس وهمکارانش جهش B RAF در ۵ مورد از۱۷۹ جهش های مورد سرطان ریه سلول بزرگ و۲۲ مورد از ۳۵ مورد ملا نوما مشخص شد.
در سال ۲۰۰۹ به وسیله ی یو وهمکارانش مشخص شدکه ۴۲ (۶۰%)مورد از ۷۰مورد آستروسیتوماهای پلی کیستی تک گیر، نو آرایی هایی در ژن B RAF دارند.میزان بالای جهش های B RAF درملانوماوفقدان درمان های موثربرای مراحل پیشرفته این بیماری پیشنهادمی کندکه ممانعت ازفعالیت B RAF استراتژی جدید مهمی برای درمان سرطان ملانومای جهش یافته است.
در سال ۲۰۱۰ به وسیله ی فلاحرتی و همکارانش رگرسیون کاملی ازجهش V600E در ارتباط با ملانومای متاستاتیک در ۸۱% از بیماران که با مهار کننده ی مخصوص به جهش V600E تحت درمان قرار گرفته بودند رسم شد.در بین این ۱۶ بیمار که تحت دز تشدیدی قرار گرفته بودند، ۱۰ مورد پاسخ جزئی داشتند و یک مورد کامل داشتند.در یک گروه ۳۲ نفری، ۲۴ مورد یک پاسخ جزئی داشتند و دو مورد پاسخ کامل داشتند.
در سال ۲۰۱۱به وسیله ی پولیکاکوس وهمکارانش سیستم مقاومتی جدیدی برای ملانومای که جهش B RAF(E600V ) دارند و با ممانعت کننده های RAFتیمار شده بودند پیدا شد.
کیم و همکارانش در سال ۲۰۰۳ بیان کردند که شایع ترین جهش V600E, BRAF در سرطان هایی که در ژن KRAS را دارند وجود ندارد.آن ها میزان وقوع جهش BRAF را در سرطان های معده و ارتباط بین جهش های KRAS, BRAF رادر این سرطان مطالعه کردند.آن ها ۷ جهش نابه جای KRAS را در ۶۶ سرطان معده و رده ی سلولی سرطان معده یافتند ولی هیچ جهش در BRAF در آن ها یافت نشد.
در سال ۲۰۰۳ لانگ و همکارانش در پیدا کردن جهش V600E در رده ی سلول های لایه ی زاینده در ۴۲ مورد از سرطان ملانومای فامیلی به شکست برخورد کردند.
در سال ۲۰۰۳ نامبا و همکارانش فرکانس جهش های را در سرطان تیروئیدو ارتباط آن ها را با پارامترهای پاتولوژیکی مشخص کرد.جهش V600E در ۴ رده ی سلولی از ۶ رده ی سلولی و ۵۱ مورد از ۲۰۷ مورد سرطان تیروئید یافت شد.
در سال ۲۰۰۴ دومینگو و همکارانش متذکر شدند که جهش های داغ V600E که در سرطان های کلورکتال یافت شد در اثر جهش در ژن های ترمیم کننده ی اشتباهات (MMR) DNA مثل MLH1 و یا MSH2 است که این ها به ارث رسیده شده است.
لوبرمیرشکی و همکارانش در سال ۲۰۰۵، ۴۵ مورد از سرطان کلورکتال را که ناپایداری ریز ماهواره داشتند (MSI) و ۳۷ مورد سرطان کلورکتال که بدون ناپایداری ریز ماهواره بودند ولی مشخصات پاتولوژیکی مشابهی داشتند را بررسی کردند و یافتند که جهش BRAF بیشتر در تومورهایی مشاهده شد که MSI یا ناپایداری ریز ماهواره ها را داشتند. بیشترین تغییر شایع BRAF، V600E فقط در تومورهایی که MSI یا ناپایداری ریز ماهواره ها را داشتند،و با متیلاسیون پروموتور MLH1 و نقص MLH1 ارتباط داشتند محاسبه شد.سن متوسط بیمارانی که جهش BRAF V600E را داشتند نسبت به بیمارانی که جهش V600E را نداشتند بیشتر بود.
در سال ۲۰۰۹ به وسیله ی تول و همکاراش یک جهش V600E سوماتیک در ۴۵ مورد از ۵۱۹ (۷/۸%) مورد سرطان کلورکتال که این جهش را داشتند مشاهده شد.
در مطالعه ای که توسط YUو همکارانش در سال ۲۰۱۳ انجام شد جهش هایBRAF در اندومتریوز و هایپریازیا مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه جهش های موجود در اگزون شمار ه۱۱ و ۱۵ ژن BRAF، در ۹۷ بیمار کارسیومای آندومتر،۹ مورد هایپر پلازیای غیر نرمال و ۲۰ مورد آندومتریال نرمال مورد تحقیق قرار گرفت. از ۹۷ مورد کارسینوما و ۹ مورد هایپرپلازی ۲۰ مورد ( ۲۱%) و ۱ مورد(۱۱%) جهش هایBRAF داشتند که در مطالعات قبلی تاکنون گزارش نشده بود. ۲۰ مورد از اندومتریوم نرمال و ۲۱ نمونه از اندومتریوم نرما ل که در نقاط کناری نقاط جهش یافته بودند هیچ جهشی در BRAF نداشتند. هیچ تفاوت ظاهری نسبت به شیوع جهش BRAF در بین مراحل، زیر گروه بافتی، یا جدی جز آن ها نبود.
این یافته ها بیان داشت که جهش در ژن BRAF به میزان بسایر کمی در اندومتریوز موثر است.
در مطالعه ای که توسط Mutch و همکارانش در سال ۲۰۰۴ بر روی جهش RAS/RAF و نقص در سیستم ترمیم DNAدر سرطان اندومتریال انجام گرفت، ۱۴۶ نفر از افرادی که اندومتریوز داشتند برای جهش های BRAF مورد بررسی قرار گرفتند. ۳۵ نفر از این بیماران برای ژن KRAS2 دارای جهش بودند ولی فقط در یک مورد جهش در ژن BRAF یافت شد، در این تحقیق به این نکته رسیدند که با وجود تشابهات زیاد بین سرطان کلون و آندومتریوز، توسعه و گسترش سرطان اندومتریوز بسیار متفاوت از سرطان کلون است(۸۱).
مطالعه ای توسط KAWAGUCHI و همکارانش در سال ۲۰۰۹ برای جهش BRAF V600E در افراد مبتلا به سرطان آندومتریال انجام شد. در این مطالعه بیان داشتند که از زمانی که جهش هایی در KRAS وBRAFدر تعداد زیادی از مواردی که از نظر ناپایداری ریز ماهواره ها (MSI) در سرطان تک گیرکلون که در ژن MLH1 نیزهایپرمتیله شده بودند، مثبت بودند مشاهده شد، ارتباطی بین MSIیا ناپایداری ریز ماهواره ها با کاهش بیان در هایپرمیتله شدن این مطالعه بر روی ۴۴ فرد بیمار انجام شد و جهش های نقطه ای در ۶ مورد از ۴۴ مورد ( %۶/۱۳) مشاهده شد ولی هیچ جهش در BRAF V600E بررسی نشد و به این نتیجه رسیدند که این جهش هدفی برای MMR در کارسینوژنز بیماران آندومتریوزنیست.پس برای یافتن ژن موثر در MMR در اندومتریوز باید مطالعات بیشتری انجام داد(۵۴).
فصل سوم:
مواد و روش ها
تمامی بیماران مبتلا به میوم ، بستری در بیمارستان میرزا کوچک خان وابسته به دانشگاه تهران مورد ارزیابی اولیه قرار گرفته و پس از بیماری یابی و تائید بیماری توسط متخصص زنان و زایمان، مشاوره و ثبت اطلاعات پرسشنامه طرح تحقیقاتی از طریق مصاحبه با بیمار و مطالعه پرونده ی بیمار انجام یافته و افراد کاندید برای بررسی انتخاب می گردند که پس از کسب رضایت اولیاء و همراهان با نمونه گیری از افراد مبتلا و در صورت امکان خانواده ی آنان به میزان cc 5 خون حاوی ماده ضد انعقاد EDTA ، استخراج DNAصورت پذیرفته و با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ کیفیت سنجی نمونه ها انجام پذیرفته و از هر بیمار حداقل ۱۰۰ میکرولیتر DNA تهیه گردیده و جهت بررسی مولکولی استفاده می گردد ، انتخاب و طراحی پرایمرهای PCR جهت بررسی جهش های موردنظر بر اساس منابع و مطالعات قبلی صورت پذیرفته و طراحی پرایمرها با بهره گرفتن از نرم افزارهای Online شامل Primer3plus, Primer design NCBI و نیز نرم افزارهای Gene runner صورت می پذیرد.
انجام بررسی ملکولی به روش TETRA ARMS-PCRدر ابتدا بر روی نمونه افراد بیمار صورت پذیرفته و سپس بر روی گروه کنترل انجام می پذیرد،بررسی درافراد سالم به عنوان کنترل و انتخاب تصادفی آن ها انجام می شود.
در این بررسی با توجه به دسترسی مشکل و هزینه های بالای بررسی تعداد ۵۰ بیمار مبتلا و ۵۰ فرد سالم مورد ارزیابی قرار می گیرند.
۳-۱ روش ها
۳-۱-۱ روش جمع آوری نمونه های خون
۳-۱-۱-۱ انتخاب بیماران
در این مطالعه،۵۰ بیمار مبتلا به میوم رحمی که در بیمارستان میرزا کوچک خان تهران بستری شده بودند و توسط پزشک متخصص تحت عمل جراحی قرار گرفته بودند انتخاب و جمع آوری شدند.علاوه بر این،سایر اطلاعات بیماران توسط فرم پرسشنامه تکمیل گردید ( پیوست ۱ ).
۳-۱-۱-۲ انتخاب افراد کنترل
تعداد ۵۰ نفر از افراد بستری در همان بیمارستان که به دلیل دیگری غیر از میوم بستری شده بودند و بیماری میوم در آن ها رد شده بود انتخاب و جمع آوری شدند.
۳-۱-۱-۳ خون گیری و شرایط نگهداری نمونه ها
مقدار ۲ تا ۵ سی سی از نمونه خون افراد بیماروکنترل در لوله های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA ریخته شد.این نمونه ها ابتدا در یخچال و سپس تا زمان استخراج در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
۳-۱-۲ استخراج DNA از خون به روش Soulthing out
در این مطالعه از روش soulthing out جهت استخراج DNA از نمونه های خون استفاده شد.
این روش نیز طی دو مرحله انجام گرفت.
مرحله اول
۵۰۰ml خون را در ویال ۱٫۵ml قرار می دهیم.
اضافه نمودن ۱۰۰۰ml آب مقطر سرد به ویال و پپتینگ نمودن آن.سپس آن را در سانتریفوژ قرار داده و با دور ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ می کنیم.(این عمل را تا سه بار تکرار می نماییم).
اضافه نمودن ۳۰۰ml N-lysis به رسوب بر جای مانده و پپتینگ نمودن آن جهت لیز شدن هسته و سپس آن را به مدت ۲ ساعت در دمای آزمایشگاه قرار می دهیم.
اضافه نمودن ۲۵۰ ml NACLاشباع و ورتکس نمودن آن جهت حذف پروتئین ها
اضافه نمودن ۶۰۰ml کلروفرم و ورتکس نمودن آنها و سپس نمونه ها را در ۴۵۰۰rpm به مدت ۴ دقیقه سانتریفوژ می کنیم.( به منظور جدا شدن DNA از سایر قسمت ها به واسطه تشکیل دو فاز مختلف).
بعد مایع رویی را در یک میکروتیوپ جدید ریخته سپس ۱۰۰۰ml اتانول سرد مطلق به آن اضافه می کنیم جهت کریستاله شدن DNA. سپس درب ویال را پارا فیلم می زنیم و آن را به مدت ۲۴ ساعت در یخچال نگه داری می کنیم.
مرحله دوم
روز بعدابتدا نمونه ها را در ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۲ دقیقه سانتریفوژ می کنیم جهت رسوب DNA . اگر DNA مشاهده نشد به مدت ۲۰ دقیقه با دور ۱۴۰۰۰rpm سانتریفوژ می کنیم.
سپس مایع رویی را دور ریخته و شستشوی نهایی با الکل ۷۰٪ به مقدار ۲۵۰ml انجام می دهیم. (این کار را تا سه بار تکرار می کنیم و هربار در ۱۰۰۰۰rpm به مدت ۱ دقیقه سانتریفوژ می کنیم).در آخرین بار الکل را دور ریخته و در ویال را باز گذاشته تا الکل کاملا خشک شود.
اضافه کردن ۷۰-۱۰۰ml آب مقطر جهت حل شدن رسوب DNA .

 

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *