فصل دوم

مروری بر پژوهشهای پیشین

۲-۱- انتقال پیام در پاسخ به تنش فلزات سنگین

پاسخ به تنش فلزات سنگین شامل یک شبکه انتقال پیام پیچیده است که به محض ورود فلز سنگین به درون سلول، سنتز پروتئین‏های مرتبط با تنش و عوامل‏ رونویسی ژن‏های پاسخ دهنده در مقابل تنش فعال می‏شود (Maksymiec, 2007). مسیر‏های انتقال پیام شامل سیستم کلسیم/کالمادولین، هورمون‏ها، تنش اکسیداتیو و فسفریلاسیون پروتئین کیناز‏های القاء شونده بوسیله میتوژن (MAPK) هست که همه موارد ذکر شده باعث فعال شدن ژن‏های مرتبط با تنش می‏شوند. مسیرهای پیام دهی مختلفی ممکن است در پاسخ به تنش فلزات سنگین مختلف مورد استفاده قرار گیرند (Dalcorso et al., 2010).

۲-۱- ۱- سیستم کلسیم/کالمادولین^[۶]

میزان کلسیم در پاسخ به برخی از عوامل تنش غیر زنده شامل افزایش دما، تنش اسمزی، تنش اکسیداتیو، کمبود اکسیژن و تنش مکانیکی افزایش می‏یابد (Knight, 1999). افزایش بیش از حد فلزات سنگین باعث ایجاد تغییر در کانال‏های ورود کلسیم می‏شود و در نتیجه باعث افزایش جریان کلسیم به داخل سلول می‏شود. کلسیم داخل سلول همراه با کالمادولین باعث انتقال پیام برای تنظیم بیان ژن‏های مؤثر در انتقال و متابولیسم فلزات سنگین و تحمل نسبت به این فلزات می‏شود (Yang and Poovaiah, 2003). با افزایش سطح کلسیم درون سلول مشاهده شده است که گیاهانی که در معرض کادمیوم قرار گرفته‏اند میزان کلسیم درون سلول آن‏ها افزایش یافته که در نتیجه آن اثر مخرب فلز در آن‏ها کمتر بوده است. سیستم کلسیم/کالمادولین همچنین در پاسخ به سمیت سایر فلزات مانند نیکل و سرب نقش دارد. گیاهان تنباکو تراریخته حاوی ژن NtCBP4 در مقابل سطوح بالای نیکل تحمل بیشتری نسبت به گیاهان نوع غیر تراریخته از خود نشان دادند و سرب بیشتری در خود انباشته کردند (Arazi et al. 1999).

۲-۱-۲- نقش هورمون‏ها

هورمون‏ها در بسیاری از فعالیت‏های فیزیولوژیک از جمله در سازگاری به تنش‏های غیر زنده مانند فلزات سنگین نقش دارند. افزایش هورمون‏ها باعث القای بیان ژن‏های مؤثر در تحمل نسبت به فلزات سنگین می‏شود (Peleg and Blumwald, 2011). برای مثال در گیاهانی که در معرض سطوح مختلف کادمیوم، مس، آهن و روی قرار گرفتند سطح بالایی از اتیلن^[۷] تولید شده است (Maksymiec, 2007). مس و روی باعث افزایش تراکم جاسمونیک اسید^[۸] در Phaseolus coccineus (Maksymiec et al., 2005) و همچنین مس باعث تراکم این هورمون در برنج و آرابیدوپسیس شده است (Rakwall et al., 1996). یکی از هورمون‏هایی که در پاسخ به تنش فلزات سنگین نقش دارد سالسیلیک اسید است. نشان داده شده است که با افزایش سطوح مختلف سالسیلیک اسید در ریشه گیاهان جویی که در معرض کادمیوم قرار گرفته بودند، توانایی سالسیلیک اسید در محافظت ریشه‏ها از پراکسیداسیون چربی ناشی از سمیت کادمیوم، افزایش یافت (Metwally et al., 2003).

۲-۱-۳- تنش اکسیداتیو

یکی از پیامد‏های عمده تجمع فلزات سنگین تولید گونه‏های فعال اکسیژن است که باعث افزایش آسیب به گیاه می‏شود. تنش اکسیداتیو در نتیجه عوامل محیطی گوناگونی اتفاق می‏افتد (Scafer and Buettner, 2001). تنش اکسیداتیو در بدترین حالت، موجب وارد آمدن خسارت به مولکول‏های حیاتی سلول می‏شود که ممکن است باعث مرگ سلولی شود. تنش اکسیداتیو طیفی از پاسخ‏های دفاعی سلولی را القا می‏کند که در برابر تنش‏های گوناگون از سلول محافظت می‏کنند، به طوری که این پاسخ‏ها ممکن است عامل اصلی سازگار شدن و تحمل به تنش‏های مختلف باشند. گونه‏های فعال اکسیژن مانند H₂O₂ به دلیل تغییر در واکنش‏های اکسید و احیای سلولی، در سلول‏های گیاهی به عنوان پیام عمل می‏کنند و از این طریق فرایند‏های سلولی را که ممکن است مستقیم یا غیر مستقیم در پاسخ به تنش نقش داشته باشند کنترل و تنظیم می‏کند (Scandalios, 2002). فلزات سنگینی از قبیل کادمیوم می‏توانند مستقیماً از طریق واکنش‏های فنتون و هابر- وایس تولید گونه‏های فعال اکسیژن کنند و تأثیر غیر مستقیم روی آنزیم‏های آنتی اکسیدانی داشته باشند (Romero-Puertas et al., 2007). مطالعات نشان می‏دهد هنگامی که آرابیدوپسیس در معرض مس و کادمیوم (Maksymiec and Krupa, 2006) و همچنین گوجه فرنگی در معرض جیوه (Cho and Park, 2000) قرار می‏گیرد تولید H₂O₂ افزایش می‏یابد. این افزایش H₂O₂ باعث فعال شدن مکانیزم‏های آنتی اکسیدانی و تولید آنتی اکسیدان‏ها می‏شود.

۲-۱-۴- مسیر MAPK

مسیر MAPK در گیاهان در هر دو نوع تنش‏های زنده و غیر زنده از قبیل افزایش دما و تنش فلزات سنگین و خشکی نقش دارد (He et al., 1999). مسیر MAPK متشکل از یک MAPKKK است که MAPKK را با فسفریله کردن بنیان‏های سرین یا ترئونین موجود در بخش کاتالیتیک آن فعال می‏سازد. MAPKK فعال شده با فسفریله کردن هر دو ترئونین و تیروزین موجود در MAPK، موجب فعال شدن آن می‏شود. MAPK‏های گیاهی در پیام دهی، تقسیم سلولی، هورمون‏ها و تنش‏های زنده و غیر زنده نقش دارند. مسیر MAPK واحدهای انتقال علائم درون سلولی هستند که انتقال پیام را از سطح سلول به هسته انجام می‌دهند (Kaur and Gupta, 2005). پیام‏های محیطی در ابتدا بوسیله گیرنده‌های خاصی دریافت می‌شوند که بدنبال دریافت این علائم، زنجیره‌ای برای انتقال علائم در درون سلول شروع و در بسیاری موارد عوامل رونویسی هسته‌ای برای القا بیان مجموعه خاصی از ژن‌ها، فعال می‌شود (Kaur and Gupta, 2005). گزارشات نشان می‏دهد که چهار ایزوفرم از ژن MAPK در گیاهچه تیمار شده با مس یا کادمیوم فعال هستند (Jonak et al., 2004) همچنین مشاهده شده است که ایزوفرم‏های این ژن در برنج تیمار شده با کادمیوم نیز فعال می‏شود (Yeh et al., 2004).

۲-۲- انواع پمپ‌های ATPase

پمپ‌های ATPase غشایی به طور کلی به سه گروه ATPase نوع P، ATPase نوعV و ATPase نوع F تقسیم می‌شوند. از دیدگاه فیزیولوژیک پروتئین‌های ATPase نوع P، یک خانواده‌ی مهم و بزرگ از پروتئین‌های غشای پلاسمایی هستند که با هیدرولیز ATP انتقال فعال کاتیون‌ها یا ترکیبات فسفولیپیدی از میان غشای پلاسمایی را تسهیل می‏کنند (Morsomme and Boutry, 2003). یکی از مهمترین پمپ‌های غشای پلاسمایی پمپ H⁺-ATPase است. این پمپ متعلق به خانواده بزرگ ATPase‌های نوع P است. این خانواده بزرگ از ۴۶ ژن در آرابیدوپسیس و ۴۳ ژن در برنج تشکیل شده است (Baxter et al. 2003). ژن‌های رمزکننده‌ی پمپ پروتون غشای پلاسمایی برای اولین بار از قارچ‌ها و گیاهان جداسازی و همسانه^[۹] شدند (Pardo and Serrano, 1989). ژن‌های ATPase‌ نوع P به ۱۰ شاخه‌ی فیلوژنتیک تقسیم شده‌اند، که شش شاخه در گیاهان یافت شده است. این شش شاخه عبارتند از پمپ‌های پروتونی (زیر خانواده‌ی P3A)، پمپ‌های فلزات سنگین (زیرخانواده‌ی P1B)، Ca²⁺-ATPase دستگاه گلژی (زیرخانواده‌ی P2A)، Ca²⁺-ATPaseخود بازدارنده^[۱۰] (زیرخانواده‌ی P2B)، ATPase آمینوفسفولیپید فعال (زیرخانواده‌یP4 ) و ATPase‌ نوع P5 (Duby and Boutry, 2009).
H⁺-ATPase های غشای پلاسمایی انتقال دهنده H⁺ هستند، پروتون‏ها را به بیرون سلول پمپ می‏کنند و موجب ایجاد شیب الکتروشیمیایی در دو سوی غشای پلاسمایی می‏شوند. پمپ پروتونی H⁺-ATPase غشای پلاسمایی، نیروی محرک پروتونی^[۱۱] را در عرض غشا‏ی پلاسمایی ایجاد می‏کند که برای انتقال ثانویه که انجام آن به نیروی محرک پروتونی وابسته است، لازم است (Palmgren, 2001). H⁺– ATPase غشای پلاسمایی فقط در گیاهان و قارچ‏ها یافت شده است. تمامی ATPase‌های انتقالی نوع P دارای شباهت‌هایی در توالی اسیدآمینه‌ای خود، به خصوص در نزدیکی اسید آمینه‌ی آسپارتات که متحمل فسفوریلاسیون می‌شود، بوده و همگی به ترکیبات وانادات حساس هستند (Boutry and Morsomme, 1999).
دسته‌ی متفاوت دیگری از ATPaseهای انتقال‌دهنده‌ی پروتون، مسئول اسیدی نمودن اندامک‌های داخل سلولی در بسیاری از موجودات زنده می‌باشند. واکوئل‌های موجود در قارچ‌ها و گیاهان آلی دارای pH بین ۳ تا ۶ هستند در حالی که pH سیتوزولی برابر ۵/۷ است، این اختلاف، حاصل عمل پمپ‌های پروتونی ATPase نوع V (واکوئولی) و پیروفسفاتاز می‌باشد. پمپ‌های پروتونی ATPase نوع واکوئلی مسئول اسیدی نمودن لیزوزوم‌ها، دستگاه گلژی و وزیکول‌های ترشحی سلول‌های حیوانی هم هستند (Boutry et al., 2003). از نظر ساختمانی ATPase نوع واکوئلی ارتباطی با انواع P نداشته و توسط وانادات مهار نمی‌شود و دچار فسفوریلاسیون و دفسفوریلاسیون چرخه‌ای نیز نمی‌شود. از نظر ساختمانی و احتمالاً مکانیزم، پمپ‌های پروتونی ATPase نوع واکوئلی با خانواده‌ی سوم پمپ‌های پروتونی، یعنی ATPase نوع F شباهت دارند (Boutry and Morsomme, 1999).

۲-۳- H⁺-ATPase و تحمل تنش شوری

تنش شوری یک تنش غیر زنده پیچیده است که در آن هر دو جزء یونی و اسمزی دخالت دارند. امروزه مشخص شده است که پمپ پروتونی H⁺-ATPase غشای پلاسمایی در مکانیزم‌های تحمل تنش شوری شرکت دارد. نمک برای سلول‌های گیاهی سمی است. برای جلوگیری از تجمع آن در سیتوزول، گیاهان دارای مکانیزم‌های پیشرفته در انتقال ثانویه هستند (Boutry and Morsomme, 1999). از جمله راه‌کار‌هایی که گیاهان برای جلوگیری از تجمع Na⁺ در سیتوزول استفاده می‌کنند، می‌توان به کاهش ورود Na⁺، انباشت واکوئلی Na⁺ به وسیله آنتی‏پورترNa⁺/H⁺ واکوئلی مانند AtNHX1 و AtNHX2 در غشای تونوپلاست آرابیدوپسیس و نیز انتقال Na⁺ به خارج از سلول از طریق آنتی‏پورتر Na⁺/H⁺ غشای پلاسمایی اشاره کرد (Boutry and Morsomme, 1999). بسیاری از انتقال‌دهنده‌ها به صورت سیمپورتر یا آنتی‏پورتر با پروتون کار می‏کنند،‏ مانند آنتی‏پورترهای Na⁺/H⁺ غشای‌پلاسمایی که در انتقال Na⁺ به خارج از سیتوزول در تنش شوری دخالت دارند و انرژی لازم برای فعالیت خود را از فعالیت پمپ H⁺-ATPaseغشای پلاسمایی بدست می‌آورند (Boutry and Morsomme, 1999).
مشخص شده است که در برنج جهش یافته متحمل به شوری میزان بیان ژن رمز کننده H⁺-ATPas غشای پلاسمایی (ژن OSA3) در ریشه‏ها نسبت به تیپ وحشی بیشتر است (Zhang et al. 1999). کنترل حرکت یون از دو سوی غشای پلاسمایی و تونوپلاست برای پایین نگه‏ داشتن غلظت Na⁺ در سیتوزول، عامل کلیدی سلول برای تحمل تنش شوری است. تنظیم غلظت یون‏ها در دو سوی غشای پلاسمایی از طریق شیب الکتروشیمیایی تولید شده به وسیله‌ی H⁺-ATPase غشای ‏پلاسمایی انجام می‌شود. فعالیت H⁺-ATPase غشای پلاسمایی به وسیله‌ی نور، هورمون‏ها، تغییرات تورژسانس سلولی و نیز کلرید سدیم تنظیم می‌شود. زمانی که گیاه تحت تنش شوری قرار می‏گیرد برای تراوش نمک اضافی از سیتوزول به وسیله‌ی آنتی‏پورترNa⁺/H⁺ غشای پلاسمایی نیاز به نیروی محرک پروتونی دارد، که این نیروی محرک به وسیله‌ی H⁺-ATPase غشای پلاسمایی فراهم می‏شود، به گونه‏ای که H⁺ را خلاف شیب غلظت به خارج سیتوزول پمپ می‏کند و آنتی‌پورتر Na⁺/H⁺ غشای پلاسمایی از این شیب پروتونی برای انتقال Na⁺ به خارج سیتوزول استفاده می‏کند (Boutry and Morsomme, 1999). امروزه طی تحقیقاتی مشخص شده است که پمپ پروتونی غشای پلاسمایی در گیاهان هالوفیت تحت تنش شوری غیر فعال نمی‌شود اما در سایر گیاهان از فعالیت آن کم می‌شود (Muramatsu et al., 2002).
سیبل^[۱۲] و همکاران (۲۰۰۵) نقش پمپ‌پروتونی غشای پلاسمایی در واکنش گیاهان به تنش شوری در یونجه چند ساله Medicago arborea و گونه نزدیک به آن Medicago citrina را مورد بررسی قرار دادند. نتیجه این بررسی نشان داد که ممانعت از تثبیت CO₂و رشد برگ‎ها در M. arborea بیشتر از M. citrina صورت می‎گیرد. جداسازی غشای پلاسمایی خالص شده و کمی کردن پروتئین H⁺-ATPase به وسیله آنالیزهای وسترن بلات نشان‌دهنده افزایش فعالیت پمپ‌ پروتونی تحت شرایط تنش شوری در برگ‎های در حال گسترش و یا برگ‎های گسترش یافته M. citrina بود در حالی که هیچ تفاوتی در برگ‎های در حال گسترش و گسترش یافته M.arborea مشاهده نشد. افزایش بیان H⁺-ATPase غشای پلاسمایی در گسترش برگ‎ها و تبادل یونی در گیاهان تحت تنش شوری مؤثر ذکر شده است.

۲-۴- H⁺-ATPase و تحمل تنش فلزات سنگین

هنگامی که سلول‏های زنده در معرض فلزات سنگین قرار می‏گیرند، غشای پلاسمایی به عنوان اولین مانع برای حرکت یون‏های فلزی به داخل سیتوپلاسم می‏باشد (Morsomme and Boutry, 2000). مشاهده شده است که فلزات باعث آسیب به غشای پلاسمایی می‏شوند. یون‏های فلزی به آسانی به گروه‏های سولفیدریل پروتئین‏ها و گروه‏های هیدروکسیل فسفولیپید‏ها متصل می‏شوند (Devi and Prasad, 1999). همچنین می‏توانند جایگزین یون‏های کلسیم در غشای سلولی شده و باعث اختلال در غشای پلاسمایی و تعادل یونی سلول می‏شوند (Breckle and Kahle, 1992). تعدادی از گزارشات نشان می‏دهد که فعالیت پمپ پروتونی غشای پلاسمایی تحت تنش فلزات سنگینی مانند (کادمیوم، مس و نیکل) تغییر می‏کند. اثر فلزات سنگین روی فعالیت H⁺– ATPase غشای پلاسمایی بستگی به مدت زمان قرار گرفتن گیاه در معرض فلزات، نوع و غلظت فلز و همچنین گونه‏ی گیاه دارد. در ریشه‏های خیار تیمار شده با کادمیوم و مس و همچنین ریشه‏های یولاف تیمار شده با Mμ ۱۰۰ کادمیوم‏ فعالیت H⁺-ATPase غشای پلاسمایی کم شده است (Astolfi et al., 2003؛Janicka- Russak et al., 2008 ). تأثیر مشابه‏ای در ذرت تیمار شده با کادمیوم برای ۴ روز مشاهده شده است (Astolfi et al., 2005). در برنج تیمار شده برای ۵ یا ۱۰ روز با Mμ ۱۰۰ کادمیوم و مس افزایش فعالیت این پمپ گزارش شده است (Ros et al., 1992). تیمار گیاه برنج برای مدت ۵ یا ۱۰ روز با Mμ ۱۰۰ و Mμ ۵۰۰ نیکل باعث تحریک فعالیت این پمپ در ساقه آن شده است (Ros et al., 1992). همچنین بیان ژن CsHA3 که رمز کننده یک پمپ غشای پروتونی در خیار است، تحت تنش Mμ ۱۰۰ کادمیوم در ریشه خیار کاهش یافته است (Janicka- Russak et al., 2008).

فصل سوم

مواد و روش‏ها

۳-۱- جمع آوری نمونه‌ها‌ی گیاهی

بذور گیاه A. littoralis از منطقه‌ی پل فسا واقع در جنوب شهر شیراز جمع‏آوری و در گلخانه بخش زراعت و اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه شیراز کشت شدند. برگ گیاهان رشد کرده در گلخانه جدا شده و در نیتروژن مایع منجمد و سپس به آزمایشگاه منتقل و تا زمان انجام آزمایش، در C °۸۰- نگهداری شدند.

۳-۲- کاشت بذرها

بذرهای گیاه A. littoralis با محلول هیپوکلریت سدیم ۵/۲٪ به مدت ۱۵ دقیقه ضد عفونی شدند و سپس بذرها با آب اتوکلاو شده شسته شدند. بعد از آن بذرها به پتری
دیشهای استریل شده حاوی کاغذ صافی منتقل شدند و در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۷۲ ساعت نگهداری شدند تا جوانه زنی بذرها یکنواخت صورت گیرد. پتری دیشها به اتاقک رشد تحت شرایط ۱۶ ساعت نور و ۸ ساعت تاریکی با دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی ۵۰% منتقل شدند و سپس بعد از ۱۲ روز که از جوانه زنی بذر‏ها گذشت آن‏ها را به گلدان‏هایی که با ۳۰۰ گرم پرلیت^[۱۳] پر شده بودند و قبل از کشت با ۱ لیتر محلول
هوگلند^[۱۴] جدول ( ۳-۱) با ۶ – ۵/۵pH= اشباع شده بود منتقل شدند. پس از کشت گیاهچه‏ها در گلدان هر ۳ روز یک بار با محلول هوگلند به میزانml 250 به طور یکنواخت آبیاری شدند.
شکل ۳-۱- گیاه رشد کرده A. littoralis درون پرلیت پس از ۲ ماه.

۳-۳- اعمال تیمار

پس از دو ماه تیمار‏های NaCl, AgNO3, HgCl₂, Pb(NO₃) _۲ هر کدام در دو سطح اعمال شدند جدول (۳-۲). سپس از برگ گیاهان در چهار بازه زمانی (۰، ۶، ۴۸ و ۷۲ ساعت) نمونه برداری انجام شد. جهت بررسی مورفولوژیک بعد از اعمال تیمار‏ها از هر گلدان به طور تصادفی چند گیاه برداشت شد و طول و وزن ریشه و ساقه و گیاه کامل اندازه گیری شد.
شکل ۳-۲- اندازه گیاه A. littoralis پس از دو ماه بدون اعمال تیمار.

۳ -۴- محلول هوگلند

در این تحقیق برای آبیاری گیاهان از محلول هوگلند که دارای عناصر کم مصرف و پر مصرف مورد نیاز گیاه است با pH حدود پنج تا شش استفاده شد.
جدول ۳-۱- عناصر تشکیل دهنده محلول هوگلند.

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.