۱- به ازای هر نمونه ۱۰۰ میکرولیتر از باکتری کشت داده شد و ۷۵۰ میکرولیتر از محیط کشت C-medium که قبلا به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد نگهداری شده بود با هم مخلوط شد و برای مدت ۳ تا ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در یک فالکون روی شیکر قرار داده شد تا مخلوط شوند.
۲- به میزان۱۱۰ میکرولیتر از محلول TA و ۱۱۰ میکرولیتر از محلول TB با هم مخلوط شده و روی یخ قرار داده شد.
۳- به میزان ۸۵۰ میکرولیتر از باکتری و محیط C-medium که روی شیکر قرار داشت به یک تیوب ۵/۱ میکرولیتری منتقل و برای مدت ۱ دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد.
۴- محلول رویی حذف شده و ۱۵۰ میکرولیتر از محلول (TA+TB) به محلول مرحله ۳ اضافه و به ‌خوبی مخلوط شد تا رنگ آن شیری شد.
۵- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۶- تیوب‌ها برای مدت ۱ دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ شدند.
۵- محلول رویی حذف شد و به رسوب ۶۰ میکرولیتر از محلول (TA+TB) اضافه شد و به ‌خوبی مخلوط شد تا رنگ آن شیری شد.
۷- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند.
۸- به میزان ۶ میکرولیتر از محصول اتصال که برای مدت ۲ دقیقه روی یخ قرار داده شده بود به تیوب‌ها اضافه شد.
۹- تیوب‌ها برای مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شدند و سپس ۶۶ میکرولیتر از هر تیوب روی محیط جامد حاوی µg/ml 50 آمپی‌سیلین به ‌صورت چمنی کشت داده شد.
۱۰- پتری‌دیش‌ها برای تمام مدت شب در ۳۷ درجه قرار داده شدند.

۳-۱۳-۳- انتخاب همسانه‌ها

برای تایید و اطمینان از انتقال دی‌ان‌ای نوترکیب مورد نظر به باکتری‌ها، از کلنی‌هایی که روی محیط حاوی µg/ml 50 آمپی‌سیلین رشد کرده بودند تک کلنی‌هایی انتخاب و در کلنی پی‌سی‌آر استفاده شدند. جهت انجام کلنی پی‌سی‌آر به هر تیوب، پنج میکرولیتر محیط کشت LB اضافه شد و با سر لوپ از کلنی‌های منتخب، برداشته شد و برای تمام مدت شب در ۳۷ درجه سانتیگراد روی شیکر رشد داده شدند. یک میکرولیتر از محلول رشد کرده به‌ جای دی‌ان‌ا طبق جدول (۳-۱۲) عمل پی‌سی‌آر انجام شد. پس از اتمام واکنش پی‌سی‌آر، محصول پی‌سی‌آر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد.
جدول ۳-۱۲- چرخه‏های دمایی واکنش کلنی‏ پی‏سی‏آر.

واکنش دما زمان
واسرشت سازی اولیه ۹۵ ۴ دقیقه
۳۵ چرخه واسرشت سازی ۹۴ ۳۰ ثانیه
اتصال ۶۰ ۳۰ ثانیه
برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.