منبع پایان نامه با موضوع سازی، Swim-up، Direct، میانگین

7- لام به مدت 15 دقیقه در محلول شماره دو در دمای اتاق قرار داده می شود.
8- سپس لام را به مدت 2 دقیقه در محلول شماره سه در دمای اتاق قرار داده می شود.
9- بعد لام در سری های الکل 70 درصد،90 درصد و100 درصد هر کدام به مدت 2 دقیقه قرار داده می شود. این کار برای آبگیری از نمونه ها لازم می باشد. استفاده از سری های الکل برای آبگیری به این دلیل است که فرایند آبگیری آهسته انجام شود و سلول به یکباره آسیب نبیند.سپس لام در دمای اتاق گذاشته می شود تا خشک شود.
10- در داخل یک لوله رنگ رایت با محلولPBS به نسبت یک به یک مخلوط می شود، سپس این مخلوط با سمپلر بر روی تمام لام ریخته می شود و به مدت 10 دقیقه زمان داده می شود.
11- لام در آب روان قرار داده می شود تا زمانی که آب شفاف شده و اثری از رنگ رایت در آب دیده نشود.
12- لام در مجاورت هوا قرار داده می شود تا خشک شود.
13-حال لام برای آنالیز از نظر قطعه قطعه شدن DNA آماده شده است، لام آماده شده با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 بررسی می شود و تعداد 100 اسپرم شمارش می شود و میزا ن سلول هایی که دچار قطعه قطعه شدن DNA شدند به صورت درصد بیان می شود، قطعه قطعه شدن DNA بر اساس تشکیل هاله در اطراف سر اسپرم به 4 حالت می باشد که عبارتنداز(Fernandez, et al., 2003):
1-هسته اسپرم با هاله بزرگ ( بدون قطعه قطعه شدن DNA)
2-هسته اسپرم با هاله متوسط( بدون قطعه قطعه شدن DNA)
3-هسته اسپرم با هاله کوچک( دارای قطعه قطعه شدن DNA)
4-هسته اسپرم بدون هاله(دارای قطعه قطعه شدن DNA) 2-3-5- روش رنگ آمیزی تانل
ابتدا غلطت نمونه شسته شده به 20 میلیون رسانده و اسمیر تهیه می شود. پس از خشک شدن اسمیر ها در دمای اتاق مراحل زیر به ترتیب انجام می شود :
1-فیکس کردن اسمیرها : الف)پارافرمالدهید 4% در PBS با PH=7.4 (بمدت 20 دقیقه در دمای 15 تا 25 سانتیگراد).
ب) یا در متانول 100% بمدت 4 دقیقه (نگهداری طولانی مدت در فریزر).
2-لام های فیکس شده در جا لامی گذاشته و آنها به مدت 30 دقیقه در محلول (×1) PBS که از قبل تهیه شده قرار داده می شود. نقش PBS شستشوی نمونه می باشد.
3-انکوباسیون با محلول blocking ( H2O2 3% در متانول) بمدت 10 دقیقه در دمای 15 تا 25 سانتی گراد صورت می گیرد.
4-سپس با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده می شود.
5-انکوباسیون با محلول تریتون 1/0 درصد در سدیم سیترات 1/0 درصد این محلول باید به صورت تازه ساخته شود و روی یخ بمدت 2 دقیقه در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد صورت می گیرد ، تریتون باعث نفوذ پذیری غشای سلول ها می شود.
6- سپس با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده می شود.
7-محلول TUNEL بمدت 1 ساعت در محیط تاریک، مرطوب و دمای 37 درجه قرار داده می شود. این محلول طبق پروتکل کیت مصرفی تهیه می شود به این صورت که کیت را که در فریزر نگهداری می شود را بیرون آورده می شود و به مدت یک الی دو دقیقه در محیط گذاشته تا از حالت یخ به صورت مایع تبدیل شود. بعد برای هر لام، 5 میکرو لیتر محلول آنزیم و 45 میکرو لیتر محلول لیبل درون یک میکروتیوپ با هم مخلوط می شود و به تمام قسمت های لام ریخته می شود. ظرف مستطیل شکل بزرگی برداشته، دو میله به صورت موازی در آن گذاشته می شود و لام ها روی میله ها چیده می شود، کمی آب مقطر ته ظرف ریخته می شود تا مرطوب بماند، پس از گذاشتن در ظرف، ظرف به مدت یک ساعت درون انکوباتور قرار داده می شود تا واکنش های مربوطه صورت گیرد.
8- سه مرتبه به وسیله ی PBS، هر مرتبه به مدت 5 دقیقه شستشو داده می شود.
9-سپس انکوباسیون با converter – probe بمدت 30 دقیقه در انکوباتور 37 درجه صورت می گیرد.
10- با محلول(4.5 µl substrate (H2O2) + 500µl DAB) DAB بمدت20 دقیقه در محیط تاریک، مرطوب و دمای 37 درجه انکوبه می شود.
11-دوباره عمل شستشو با PBS انجام می شود.
12- به وسیله ی رنگ هماتوکسیلین به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی می شود.
13- آبگیری در الکل های 25، 50، 75 و 100 درصد هر کدام 5 دقیقه صورت می گیرد.
14-شفاف سازی لام ها به وسیله ی زایلن و چسباندن توسط چسب انتلان انجام می شود.
15-سپس با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X100 مشاهده می شود و تعداد 100 اسپرم شمارش می شود.
سلولهای با رنگ قهوه ای تیره دارای شکستگی DNA می باشد و TUNEL+در نظر گرفته شد.
2-3-6- آنالیز آماری
برای آنالیز آماری نرم افراز SPSS 15 مورد استفاده قرار گرفت. از آزمون T test – Independent Sample برای مقایسه پارامترهای سیمن قبل و بعد از شستشو استفاده شد. از تست ANOVA یک طرفه با تست تکمیلی Tukey برای مقایسه آسیب به DNA اسپرم بین گروه های مختلف استفاده شد. جهت بررسی بین زمان انکوباسیون و آسیب DNA اسپرم آزمون Pearson خطی مورد استفاده قرارگرفت. فرضیه ما دو دامنه بوده است. سطح معنا داری برای P value کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.
فصل سوم نتایج
3-1- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی تحرک اسپرم
در زمان قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم 57/2±48/20 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم به 27/3±52/42 افزایش یافت.
اختلاف درصد میانگین حرکت سریع بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت سریع اسپرم 48 درصد و کمترین مقدار آن 3 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت سریع اسپرم 62 درصد و کمترین مقدار 8 درصد اندازه گیری شد.
همچنین در زمان قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت کند اسپرم 30/2±24/43 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت کند اسپرم به 80/3±71/47 افزایش یافت.
از نظر آماری اختلاف معنی داری بین درصد میانگین حرکت آهسته اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Direct Swim-up وجود نداشت (325/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت کند اسپرم 63 درصد و کمترین مقدار آن 24 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت کند اسپرم 88 درصد و کمترین مقدار 27 درصد اندازه گیری شد.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت درجا اسپرم 708/0±36/5 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت سریع اسپرم به 752/0±24/4 کاهش یافت.
اختلاف درصد میانگین حرکت درجا بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی از نظر آماری معنی دار نبود (0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت درجا اسپرم 15 درصد و کمترین مقدار آن 2 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت درجا اسپرم 15 درصد و کمترین مقدار 1 درصد اندازه گیری شد.
تفاوت درصد میانگین اسپرم های بی حرکت قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up افزایش معنی داری نشان داد(0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین اسپرم های بی حرکت 63/1±81/29 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین اسپرم های بی حرکت به 572/0±52/5 کاهش یافت.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار اسپرم بی حرکت 41 درصد و کمترین مقدار آن 18 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار اسپرم بی حرکت 12 درصد و کمترین مقدار 1 درصد اندازه گیری شد.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت پیشرونده اسپرم 83/1±71/63 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین حرکت پیشرونده اسپرم به 02/1±10/90 افزایش یافت.
اختلاف درصد میانگین حرکت پیشرونده اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت پیشرونده اسپرم 77 درصد و کمترین مقدار آن 51 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار حرکت پیشرونده اسپرم 98 درصد و کمترین مقدار 82 درصد اندازه گیری شد.
نمودار3-1: مقایسه میانگین حرکت پیشرونده، حرکت سریع و حرکت کند قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Swim-up
3-2- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قابلیت حیات اسپرم
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قابلیت حیات اسپرم 65/1±29/82 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قابلیت حیات اسپرم به 000/0±100 افزایش یافت.
اختلاف درصد میانگین قابلیت حیات اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار قابلیت حیات اسپرم 91 درصد و کمترین مقدار آن 70 درصد و بعد از Direct Swim-up مقدار قابلیت حیات اسپرم 100 درصد اندازه گیری شد. 3-1- رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای سنجش میزان زنده یا مرده بودن اسپرم:A : اسپرم های که سر آن ها سفید است و رنگ به خود نمی گیرند اسپرم های زنده تلقی می شوند.B : اسپرم های که سر آن ها صورتی یا قرمز است، اسپرم های مرده تلقی می شوند. 3-3- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی مورفولوژی اسپرم
اختلاف درصد میانگین مورفولوژی طبیعی اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به قبل از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین مورفولوژی طبیعی اسپرم 10/3±00/49 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین مورفولوژی طبیعی اسپرم به 53/2±33/72 افزایش یافت.
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار مورفولوژی طبیعی اسپرم 76 درصد و کمترین مقدار آن 30 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار مورفولوژی طبیعی 90 درصد و کمترین مقدار 52 اندازه گیری شد. نمودار3-2: مقایسه میانگین قابلیت حیات و مورفولوژی اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up 3-2- رنگ آمیزی پاپانیکولا باعث رنگ شدن آکروزوم و بعد از آکروزوم ، قسمت سر وقطعه میانی می شود که سر رنگ آبی وقطعه میانی به رنگ قرمز یا صورتی در می آید.
3-4- نتایج اثر آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم 59/2±24/22 بود و پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up ، درصد میانگین قطعه قطعه شد ن DNA اسپرم به 809/0±38/4 کاهش یافت.
اختلاف درصد میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up نسبت به بعد از آماده سازی بطور معنی دار افزایش یافته بود(0001/0P ).
قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up بیشترین مقدار قطعه قطعه شدن DNA اسپرم 43 درصد و کمترین مقدار آن 8 درصد و بعد از Direct Swim-up بیشترین مقدار قطعه قطعه شدن DNA اسپرم 17 درصد و کمترین مقدار 1 درصد اندازه گیری شد. نمودار3-3: مقایسه میانگین حرکت پیشرونده و قطعه قطعه شدن DNA اسپرم قبل و بعد از آماده سازی به روش Swim-up
جدول3-1-مقایسه پارامترهای اسپرمی قبل و بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up شاخص ها متغیرها
میانگین مقدار P
(سطح معنی داری)
قبل از آماده سازی اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم حرکت سریع %
57/2±48/20
27/3±52/42
0001/0 *
حرکت آهسته %
30/2±24/43
80/3±71/47
325/0
حرکت درجا %
708/0±36/5
752/0±24/4
0001/0 *
بی حرکت %
63/1±81/29
572/0±52/5
0001/0 *
حرکت پیشرونده %
83/1±71/63
02/1±10/90
0001/0 *
مورفولوژی طبیعی%
10/3±00/49
53/2±33/72
0001/0 *
قابلیت حیات % 65/1±29/82
000/0±100
0001/0 *
قطعه قطعه شدن DNA %
59/2±24/22
809/0±38/4
0001/0 * *: معنی دار در سطح 05/0 (P value=0.05)
3-5- نتایج اثر زمان های مختلف انکوباسیون(3،2،1،0ساعت) بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up برروی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم
بلافصله بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up (زمان صفر) درصد میانگین قطعه قطعه شدن DNA اسپرم 809/0±38/4، یک ساعت بعد از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد 890/0±14/6، دو ساعت بعد از انکوباسیون 935/0±81/8 و سه ساعت بعد از انکوباسیون 894/0±76/10 گزارش شد.
میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up (زمان صفر) نسبت به پس از یک ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد بطور معنی دار افزایش نیافته بود(497/0P ) اما پس از دو ساعت و همچنین سه ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای 37 درجه سانتی گراد نسبت به زمان صفر میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم اختلاف معنی داری پیدا کرد (004/0P ، 0001/0P ).
]]>

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *