دانلود پایان نامه

جهت تشخیص و بررسی میزان شکستگیها در DNA اسپرم ابتدا ساختار DNA را با تغییر غلظت PH دناتوره کرده و سپس با مواد قلیایی باعث جدا شدن محلهای شکسته شده از یکدیگر در ساختار DNA میشود. پس از دناتوره شدن و خارج شدن پروتئینها با استفاده از محلول لیز کننده، تکرشتههای شکسته شده با پروب DNA هیبرید میشوند. با استفاده از این روش میتوان میزان شکستگی DNA را به صورت شاخص DNA fragmentation بیان کرد. همانند روش قبل، این روش جهت استفاده کلینیکی مناسب نیست. همچنین این روش تنها روشی است که ارزیابی آسیب را، سلول به سلول، در جایگاهی از توالی خاص DNA انجام میدهد(Fern?ndez & Gos?lvez, 2002).
1-12-1-3- روش Comet
یکی دیگر از روشهای مفید جهت بررسی آسیب DNA در یک یا دو رشته آن، روش Comet است. پیش از این برای انجام این روش از شرایط بافری خنثی برای شکستگیهای دو رشته DNA استفاده میشد. سپس با کمی تغییرات از بافر الکتروفورز قلیایی جهت بالا بردن حساسیت DNA یک و دو رشتهای نسبت به شکستگیها استفاده شد. با استفاده از این روش میتوان علاوه بر تشخیص انواع مختلف فراگمنتاسیون DNA، مانند نکروز و آپوپتوز، میزان شکستگیها را نیز تشخیص داد. اساس این تکنیک شناسایی شکستگیها در یک یا دو رشته DNA با استفاده از دستگاه الکتروفورز است(Duty, et al., 2002).
1-12-1-4- رنگآمیزی CMA3
کرومومایسین A3(CMA3) به عنوان یک رنگ فلورسنت در تحقیقات سیتو ژنتیک استفاده میشود. با استفاده از این رنگآمیزی میتوان به صورت غیر مستقیم ساختار کروماتین را مورد بررسی قرار داد. این ترکیب جهت اتصال به شیار بزرگ در ساختار DNA با مولکول پروتامین رقابت میکند. بنابراین، این تکنیک مشخص کننده نقص در بستهبندی کروماتین (کمبود پروتامین)، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته است. نتایج مطالعات مختلف نشان داده که ارتباط معنیداری بین کمبود پروتامین بررسی شده به روش رنگآمیزی CMA3 در اسپرم و میزان لقاح در بیماران کاندیدا ICSI و IVF وجود دارد(Iranpour, Nasr-Esfahani, Valojerdi, & Taki Al-Taraihi, 2000).

شکل 1-2- ارزیابی آسیب DNA توسط: A.TUNEL, B.COMET, C.CMA3

1-12-1-5- تکنیک SCSA
اساس این روش وجود حساسیت ساختار کروماتین و DNA هنگام مواجه با اسید و ویژگیهای متا کروماتیک آکریدین اورانژ است. این فلوروکروم به عنوان یک منومر بین دو زنجیره DNA قرار میگیرد و زمانی که DNA طبیعی است رنگ سبز و زمانی که فلوروکروم با تک رشتهای DNA ترکیب شود، رنگ قرمز-نارنجی از خود ساطع میکند. اسپرمهای رنگ گرفته توسط فلوسایتومتری مشخص میشوند. محققان در مطالعات بالینی بیشتر از این روش استفاده میکنند، با به کارگیری این روش میتوان میزان موفقیت باروری را در افراد مشخص کرد(Evenson, Larson, & Jost, 2002).
1-12-1-6- تست SCD
یکی دیگر از روشهایی که اخیراً جهت بررسی آسیب DNA اسپرم به کار گرفته شده است، روش پراکندگی کروماتین اسپرم66 است که اساس آن شبیه تکنیک SCSA و بر اساس مستعد بودن شکستیهای DNA جهت تخریب در هنگام مواجه با اسید است. وجود آسیب در DNA اسپرم با استفاده از وجود هالههای کروماتین خارج شده از تراکم در اطراف هسته اسپرم تشخیص داده میشود. از مزایای این روش، آسان، مقرون به صرفه و حساس بودن است. هر چند نتایج کلینیکی این تکنیک مورد بررسی قرار نگرفته ولی به نظر میرسد که میتوان از آن به صورت معمول در آزمایشگاههای آندرولوژی استفاده کرد(Fernandez, et al., 2003).

شکل1-3- تست SCD
1-12-1-7- رنگآمیزی آکریدین اورانژ
استفاده از رنگ متا کروم آکریدین اورانژ یکی دیگر از روشهای بررسی آسیب DNA اسپرم است. اساس این تکنیک مانند SCSA است. مشکل اساسی این تکنیک متغیر بودن مشاهدهگر برای تشخیص رنگ فلورسنت بین سبز و نارنجی است که احتمالاً یک سری رنگهای حد واسط با یک حساسیت متفاوت برای دناتوره شدن اسپرم وجود دارد(Nasr-Esfahani, Razavi, & Mardani, 2001) .
1-12-1-8- رنگآمیزی تولوئیدین بلو
تولوئیدین بلو یک رنگ متا کروم مرتبط با هسته اسپرم و کروماتین آن است. این رنگ پس از اتصال به کروماتین غنی از هیستون سرشار از لیزین، بنفش پررنگ میشود. در صورتی که اگر به کروماتین غنی از پروتامین اتصال یابد آبی کمرنگ میگردد. این رنگآمیزی جهت بررسی میزان بلوغ هسته و تراکم کروماتین به کار میرود. این تست ساده، کم هزینه و با میکروسکوپهای معمولی قابل اجراست(Krzanowska, 1982) .
1-13- روش مهاجرت اسپرم67
این روش قدیمیترین روش جداسازی اسپرم است که به طور معمول مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک اولیهی که توسط ماهادوان و بیکر(Mahadevan & Baker, 1984) در سال 1984 شرح داده شد، هنوز هم به طور گستردهای در آزمایشگاههای IVF کاربرد دارد. استفاده از این تکنیک در بیمارانی با پارامترهای اسپرمی نامناسب محدودیت دارد، اما برای افرادی با اسپرم طبیعی، روش استاندارد و قابل اعتمادی است(Henkel & Schill, 2003). اساس روش Swim up بر پایه حرکت فعال و پیشرونده اسپرم از رسوب اسپرم به قسمت فوقانی محیط شستشو است. در این روش بیشتر از 90 درصد اسپرمهای جدا شده حرکت داشته و از لحاظ مورفولوژی، طبیعیتر از نمونه قبل از شستشو است. همچنین در میان اسپرمهای جدا شده، سلولهای دیگر مانند سلولهای زاینده و گلبولهای سفید وجود ندارد. بازده این روش، وابسته به حرکت اسپرمها در مایع منی است(Henkel & Schill, 2003) ولی نتیجه به دست آمده به تعداد آزمایشگاهها متفاوت است، چرا که در نتیجه این روش ، عواملی مانند دفعات سانتریفیوژ، نوع محیط کشت مورد استفاده، زمان انکوباسیون و . . . دخالت دارد.
1-14- روش سانتریفیوژ شیب غلظت68
در این روش، جدا
سازی اسپرمها بر اساس جرم حجمی آنها در هنگام سانتریفیوژ صورت میگیرد. ابتدا 2 لایه مجزا از هم با غلظت متفاوت از ماده جدا کننده (Gradient) را در لولههای مخصوص تهیه کرده و سپس منی مایع شده بر لایههای Gradient قرار میگیرد. این لایههای گرادیانت از دانههای سیلیس پوشیده شده با PVP یا مولکولهای دیگر با نامهای تجاری متفاوت مانند پرکول، پیور اسپرم، و … تهیه میشود. با انجام سانتریفیوژ اسپرمهای زنده که دارای جرم حجمی بیشتری هستند (نسبت به اسپرم مرده) با سرعت بیشتری به طرف انتهای لوله حرکت میکنند. در صورتی که سلولهایی مانند سلولهای زاینده، گلبولهای سفید و باکتری که جرم حجمی کمتری دارند، آهستهتر حرکت کرده و ما بین لایههای فوقانی قرار میگیرند. با رعایت سرعت و دور چرخش سانتریفیوژ، میتوان به راحتی اسپرمهای زنده، دارای جرم حجمی بالا و اسپرمهای بالغ را از اسپرمهای مرده و یا دیگر سلولها جداسازی کرد. خلوص شیمیایی و کیفیت لایههای به کار رفته در این روش میتواند بر ساختار اسپرم تأثیر مثبت یا منفی بگذارد(Henkel & Schill2003).

مطلب مرتبط :   منابع مقاله دربارهعملکرد سازمان، رفتار کارکنان، سطح بلوغ

فصل دوم

مواد و روش ها
2-1-مواد و وسایل مورد نیاز
2-1-1-وسایل مورد نیاز
1-هود بهداد، ایران
2-هود کلاس دو Luminar Flow
3-انکوباتور(CO2 5%، 37 درجه سانتی گراد، رطوبت 95%) Memmert، آلمان
4-انکوباتور (37 درجه سانتی گراد) بهداد، ایران
5-میکروسکوپ نوری Olympus، ژاپن
6-ترازو با دقت0001/0 گرم Scaltec، سوئد
7-MAKLER COUNTING CHAMBER
8-سمپلر 10، 100، 200، 1000 میکرولیتر Barand، آلمان
9-دستگاه شمارش سلول (سل کانتر)
10-تایمر دقیق
11- دستگاه سانتریفیوژ بهداد، ایران
12-اسمولاریته سنج Gonotec
13-PH متر Percisa
2-1-2- مواد مورد نیاز
1-پودر Ham,s F10
2-سدیم بی کربنات SIGMA ،آلمان
3-آب مقطر
4-کلسیم لاکتات SIGMA ،آلمان
6- جنتامایسین
7-HCL Merck ،آلمان
8-مرکاپتواتانول Merck ،آلمان
9-تریس Merck ،آلمان
10-SDS Merck ،آلمان
11-EDTA Merck ،آلمان
12-NaCl Merck ،آلمان
13-اسید بوریک Merck ،آلمان
14-KOH Merck ،آلمان
15-ائوزین Merck ،آلمان
16-نیکروزین Merck ،آلمان
17-PBS
18-اتانول50%، 70%، 80%، 90%، 100% سینا،ایران
19-اتر
20G-6 Orang Stain- Merck ،آلمان
21-EA-50 green stain Merck ،آلمان
22-کیت تانل Roche ،آلمان
23-H2O2
24-تریتون
25-سدیم سیترات Merck ،آلمان
26-آگارز معمولی Fermentas ،آلمان
27-آگارز با نقطعه ذوب پایین SIGMA ،آلمان
28-زیلن
29-DAB
30-چسب ماونت(انتلان)

2-2- ساخت محلول های مورد نیاز
2-2-1- ساخت محلول Ham’s F10
جدول2-1- ساخت Ham’s f10
نام ماده
مقدار لازم
پودر Ham,s F10
g/dl89/9
سدیم بی کربنات
g250/1
آب مقطر
ml1000
کلسیم لاکتات
g240/0
Gentamicine 80 EXIR
cc1
1-ریختن ml1000 آب مقطر درون ارلن ml800 و ارلن ml 200.
2-اضافه و حل کردن کلسیم لاکتات درون ارلن ml200.
3-اضافه و حل کردن Ham’s f10 و سدیم بی کربنات درون ارلن ml800.
4- اضافه کردن کم کم محتوای ارلن که حاوی ml200 آب مقطر وکلسیم لاکتات بود را درون ارلن حاوی ml800 آب مقطر و Ham’s f10 و سدیم بی کربنات .
5- افزودن جنتامایسین به محلول.
6- سنجیدن اسمولاریته توسط دستگاه اسمولاریته متر ، اسمولاریته ی محلول باید Osmol/L10±275 باشد.
7- سنجش PH، PH باید 5/7 باشد.
8- فیلتر کردن محیط به دست آمده با فیلتر میلی پور m?22/0 بداخل ظروف استریل و نگهداری در یخچال تا موقع مصرف . (حداکثر مدت نگهداری در یخچال یک ماه)
2-2-2- محلول های لازم برای تست پراکندگی کروماتین اسپرم (SCD)69
محلول HCl 08/0 نرمال (660 میکرو لیتر HCI در 340/99 سی سی آب مقطر)
محلول لیز کننده یک شامل مرکاپتواتانول8/0مولار، تریس4/0مولار، SDS1% و EDTA 50 میلی مولار می باشد.
محلول لیز کننده دو شامل NaCl 2مولار، تریس4/0مولار و SDS1% می باشد.
محلول Trisborate- EDTA شامل اسیدبوریک09/0مولار، تریس09/0مولار و EDTA002/0 مولار می باشد.
PH برای تمامی محلول ها باید بر روی 5/7 تنظیم گردد.
بعد از سا
خته شدن محلول ها PH آن ها با دستگاه PHمتر اندازه گیری می شود اگر PH بیشتر از 5/7 باشد با استفاده از HCl 1 نرمال که کم کم به محلول اضافه و PH به 5/7 رسانده می شود و اگر PH کمتر از 5/7 باشد با استفاده از KOH 1 نرمال که کم کم به محلول اضافه می شود PH به 5/7 رسانده و سپس محلول ها تا موقع مصرف در یخچال نگهداری می شود(Fernandez, et al., 2003).
2-2-3- ساخت محلول تانل70
محلول تانل از ترکیب l? 5 محلول آنزیم (از ویال آبی رنگ) با l?45 محلول لیبل (از ویال بنفش رنگ) درون یک ویال حاصل می شود.
2-2-4- ساخت محلول 71 (PBS)
55/9گرم پودر PBS (یا 10 قرص آن ) در یک لیتر آب مقطر حل می شود(WHO 2010).

مطلب مرتبط :   منابع پایان نامه ارشد دربارهدرون داده، عملکرد سازمان، سلسله مراتب

2-2-5- ساخت رنگ ائوزین-نیگروزین72
67/0 ائوزین و 9/0گرم NaCl را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل و سپس 10 گرم نیگروزین به این محلول اضافه می شود. بعد با استفاده از کاغذ صافی محلول فیلتر می شود(WHO 2010).
2-2-6- ساخت رنگ رایت73

5دقیقه میکسر

5
5 دقیقه میکسر

5دقیقه میکسر

Written by 

دیدگاهتان را بنویسید